"توليد پروتئين نوتركيب اينترفرون بتاي جهش يافته-بخش متغير تك زنجيره (scFv) آنتي بادي ضد كلاژن تيپ II انساني در رده سلولي HEK293 با دورنماي درمان بيماري آرتريت روماتوئيد" پروتئين نوتركيب توليد شده در اختراع حاضر داراي دو بخش ناحيه ي متغير scFv ضد كلاژن تيپ II انساني و اينترفرون بتا مي باشد. در اين اختراع هدف از اتصال scFv ضد كلاژن تيپII انساني به اينترفرون بتاي انساني جهش يافته، انتقال اختصاصي و هدفمند اينترفرون بتا به مفصل (حاوي كلاژن تيپII) با دورنماي درماني براي بيماري آرتريت روماتوئيد بوده است. داروهاي كنوني براي درمان اين بيماري همراه با اثرات جانبي زيادي هستند درحالي كه پروتئين نوتركيب هدفمند حاضر به علت تمركز در بافت هدف با كاهش اثرات جانبي همراه خواهد بود. در اين پروژه و با استفاده از تكنولوژي DNA نوتركيب، پس از طراحي، ساخت و ترانسفكشن وكتور داراي سازه ي ژني نوتركيب IFNβ-scFv ضد كلاژن تيپII انساني به رده ي سلولي HEK293، بيان سازه ي ژني نوتركيب با روش Real-time PCR و پروتئين نوتركيب با روش هاي SDS-PAGE، وسترن بلات و In house ELISAبررسي گرديد. در انتها عملكرد اينترفرون بتا در پروتئين نوتركيب، با تأثير اين پروتئين نوتركيب بر سلول هاي تك هسته اي خون محيطي (PBMC) و سپس مشاهده ي افزايش بيان ژن MxA با تكنيك Real-time PCR تأئيد شد.

ايجاد استرپتومايسز كلاولي جروس ايرانا نوتركيب با قابليت توليد مقادير زياد آنتي بيوتيك كلاولانيك اسيد كلاولانيك اسيد اولين مهاركننده ß- لاكتاماز است كه مصرف باليني آن از سال 1981 آغاز شده است. محصول تجاري آگمنتين (كو آموكسي كلاو ) از تلفيق كلاولانيك اسيد با آموكسي¬سيلين و محصول تجاري تيمنتين از تلفيق كلاولانيك اسيد با تيكارسيلين بدست مي¬آيد. در اين پژوهش، توسط مطالعات مختلف بيوافورماتيك و بررسي نتايج آزمايشات محققين ديگر، ژن cas2 جهت تهيه كانستراكت هاي نوتركيب انتخاب شدند. استخراج DNA ژنومي از استرپتومايسز (شكل 1) انجام شد و ژن cas2 توسط PCR و پرايمرهاي طراحي و دست كاري شده، تكثير (شكل 2) و استخراج گرديد و سپس به وكتور pMT3206 (شكل 3) استخراج شده از استرپتومايسز سيلي كالر متصل شد. ترانسفورماسيون پروتوپلاست هاي استرپتومايسز ليويدانس با وكتور pMT3206 و همچنين ناقلين واجد ژن و cas2 به صورت ligation mixture انجام گرفت. سپس پلازميد نوتركيب از سوش هاي نوتركيب جدا و خالص سازي شد و پروتوپلاستهاي استرپتومايسز كلاولي جروس با آنها انجام شد. سوش نوتركيب به نام استرپتومايسز كلاوليجروس ايركاس شناخته مي شود. ميزان توليد آنتي بيوتيك ميزان كلاولانيك اسيد اين سوش با روش HPLC و بيواسي بررسي شد ( شكل 5). نتايج نشان دادند كه سوش نوتركيب ايركاس 5 برابر بيشتر از سوش طبيعي آنتي بيوتيك كلاولانيك اسيد توليد مي كند. البته اين مقدار با بهينه سازيهاي بيشتر قابل افزايش نيز هست.

رگ‌زايي يك فرآيند زيستي مهم در بسياري از شرايط فيزيولوژيك و پاتولوژيك است. VEGFها خانواده‌اي از تنظيم كننده‌هاي كليدي در رگ‌زايي بوده كه مهم‌ترين و شناخته شده‌ترين عضو اين خانواده VEGF-A مي‌باشد. در حال حاضر VEGF ها به‌طور گسترده‌اي در جهان توسط تكنيك‌هاي مهندسي ژنتيك به‌صورت نوتركيب توليد مي¬شوند و در تحقيقات مختلف رگ‌زايي، سلول‌هاي بنيادي، پزشكي ترميمي و مهندسي كشت بافت مورد مصرف قرار مي¬گيرند. VEGF-A به صورت واريانت‌هاي مختلفي وجود داشته كه حاوي اگزون‌هاي متفاوت، ويژگي‌هاي برجسته متمايز و الگوهاي بياني اختصاصي مي‌باشند. در بين تمام ايزوفرم‌هاي VEGF-A، فاكتور جديد 111VEGF با ويژگي رگ‌زايي قوي و پايداري بسيار بالا از اهميت ويژه‌اي در تحقيقات بيولوژي مولكولي برخوردار بوده و به عنوان يك فاكتور درماني پيشنهاد مي‌شود. رگ‌زايي ناقص و ايسكمي يكي از مشكلات مهم در پزشكي و در بسياري از اختلالات شامل بيماري هاي قلبي – عروقي و جراحت‌ها مي‌باشد. در اين شرايط پاتولوژيك، محيط پروتئوليتيك و مخصوصاً سرين پروتئازهايي مانند پلاسمين منجر به تجزيه‌ي VEGF-A و رگ‌زايي ناقص مي‌شوند. ويژگي رگ‌زايي قوي در واريانت 111VEGF و مقاومت آن نسبت به فرآيند پروتئوليز، آن را به كانديد جالب و جذاب براي كاربردهاي درماني در بيماري‌هاي ايسكميك تبديل نموده است. هدف از پروژهي حاضر، سنتز و كلونينگ cDNAي فاكتور رشد 111VEGF به صورت نوتركيب همراه با افزودن توالي اينتروني (براي اولين بار در جهان) به منظور بالا بردن ميزان بيان و ترجمه‌ي اين ايزوفرم مي‌باشد. در اين راستا، طي واكنش‌هاي PCR مجزا قطعات كد كننده اگزون‌هاي 4-1 و اينترون 5-4 تكثير شده و با قرار دادن توالي كد كننده جايگاه شناسايي يكي از آنزيم‌هاي نوع IIs به نام Eco31I در پرايمرهاي مورد نظر، اين دو قطعه‌ي به يكديگر متصل شده و در وكتور pBud.CE4.1 كلون گرديدند. در ادامه، پلاسميد نوتركيب pBud-VEGF111 درون باكتري E.coli Top10 ترانسفورم شده و پس از تأييد فرآيند كلونينگ درون دو لاين سلولي CHO dhfr- و HEK 293 ترانسفكت گرديد. سپس، بيان ايزوفرم 111VEGF توسط تكنيك Real time PCR و در دو لاين سلولي مورد استفاده بررسي شد. در نهايت توليد پروتئين 111VEGF از طريق دو تست دات بلات و الايزا به طور كيفي مورد مطالعه قرار گرفت. در مجموع، با توجه به روند رو به رشد تحقيقات حيطه پزشكي و زيستي در كشور، نياز به نمونه داخلي فاكتورهاي نوتركيب بيش از پيش احساس مي‌گردد. به علاوه، با توجه به گسترش آمار ابتلا به بيماري‌هاي قلبي-عروقي در سراسر جهان و ايران، توليد داروها و فاكتورهاي رشد نوتركيب در راستاي درمان و تحقيقات مورد نياز براي اين بيماري از اهميت فوق العاده‌اي برخوردار است. عملي نمودن پروژه حاضر گامي نو در راستاي پاسخ به نياز كشور در بومي‌سازي توليد انواع فاكتورهاي رشد و داروهاي نوتركيب مورد نياز در تحقيقات و پژوهش‌هاي زيست پزشكي است.